Neues Drittmittelprojekt

DFG Förderung für die Untersuchung der DNA-Interaktionsspezifität von DNA-Methyltransferasen und Demethylasen mittels „Deep-Enzymology"

DNA-Methylierung spielt eine wichtige Rolle bei der Regulation von Genexpression, genomischer Stabilität, Zelldifferenzierung und der Entwicklung von Säugern. Sie wird durch DNA-Methyltransferasen (DNMTs) eingeführt und aktive Demethylierung wird durch die Oxidation von 5-Methylcytosin durch Ten-Eleven-Translokation (TET) - Methylcytosindioxygenasen ausgelöst. Wie viele andere DNA interagierende Enzyme müssen DNMTs und TETs ihre Zielsequenzen (CpG in den meisten Fällen) in verschiedenen Sequenzkontexten identifizieren, was eine schwierige und nicht gut verstandene Aufgabe ist. Um den Einfluss flankierender Sequenzen auf die Erkennung von Zielsequenzen zu untersuchen und die Sequenzpräferenzen von DNMTs detailliert zu bestimmen, haben wir einen neuartigen „Deep Enzymology“ Ansatz entwickelt. Dabei wird ein Pool von DNA-Substraten erzeugt, die eine (modifizierte) Zielstelle enthalten, welche beidseitig von 10 randomisierten Nukleotiden flankiert wird. Der Substratpool wird methyliert und durch Bisulfitkonvertierung gefolgt von NGS analysiert. Auf diese Weise wird der Methylierungszustand einzelner Produktmoleküle mit ihren flankierenden Sequenzen bestimmt. Unsere bisherigen Studien haben dokumentiert, dass dieser Ansatz sehr leistungsfähig ist und neue und wichtige mechanistische Details aufdeckt, sowie dass Flankierungssequenz-Präferenzen von DNMTs mit zellulären DNA Methylierungsprofilen korrelieren. Hier planen wir, diese Technologie zu verwenden, um die Präferenzen für Flankierungssequenzen ausgewählter Enzyme zu untersuchen, die an der DNA-Methylierung beteiligt sind.